反式烏頭酸（trans-aconitic acid）是具有三個羧基和一個不飽和雙鍵的C6小分子有機酸，被美國能源部列為具有應用潛力的30種生物基化學品之一，同時也被發現在農業線蟲病害防治方面具有很好的效果，另外，作為被聯合國糧農組織FAO和美國FDA等批準的食品添加劑具有很好的安全性，潛在應用前景巨大。反式烏頭酸傳統上主要是通過從甘蔗制糖過程中少量提取獲得，隨后開發的化學合成方法過程復雜、副產物多、得率低，這些工藝都無法實現大規模低成本生產，使得反式烏頭酸未能形成大規模商業供應。原料可及性問題成為阻礙反式烏頭酸下游應用開發的關鍵限制性因素。
微生物制造工程中心設計構建了高效合成反式烏頭酸的微生物細胞工廠，聯合山東魯抗醫藥開發了發酵工藝并完成工程放大驗證，實現了反式烏頭酸的高效綠色生物制造，解決了關鍵的原料可及性困境，同時通過田間實驗證明反式烏頭酸可有效降低農業根結線蟲的危害。該工作近日發表于國際權威期刊Metabolic Engineering 《代謝工程》（圖1）。
圖1 反式烏頭酸的生物制造及作為殺線蟲劑田間實驗
首先，選擇具有低pH耐受能力的產衣康酸土曲霉工業菌株作為底盤細胞，通過敲除順烏頭酸脫羧酶編碼基因成功阻斷了衣康酸的生物合成，構建同時大量積累順烏頭酸和反式烏頭酸的第一代土曲霉工程菌株，總產量約10 g/L。然后，為了將順烏頭酸快速轉化為反式烏頭酸以避免進入TCA循環被消耗，通過篩選評估不同時間響應的強啟動子、不同定向整合位點、不同底盤細胞和不同烏頭酸異構酶元件，設計了異源重構烏頭酸異構化模塊的系列土曲霉菌株，獲得了更高效的第二代產反式烏頭酸細胞工廠，搖瓶發酵產量達到約20 g/L，反式烏頭酸比例從57%提高到了90%（圖2）。
圖2構建產反式烏頭酸的真菌細胞工廠
隨后，在培養基優化過程中通過多組分篩選發現反式烏頭酸發酵生產過程中的關鍵營養限制因子，并通過溶氧控制等條件優化開發了百升罐的發酵工藝，依托山東魯抗產業化中試平臺將工藝逐步放大優化到5噸罐，并完成20噸發酵規模的生產示范，發酵98小時反式烏頭酸產量達到60 g/L（圖3）。
圖3 反式烏頭酸發酵工藝從5噸到20噸工業規模放大及優化
植物寄生線蟲是一種造成巨大農業經濟損失的農業病蟲害，其防治手段非常有限。山東魯抗醫藥基于發酵生產的反式烏頭酸開展了黃瓜線蟲防治田間試驗，結果顯示使用反式烏頭酸后根結線蟲病造成的危害得到有效改善，反式烏頭酸560g畝用量與當下主流化學殺線劑噻唑膦180g畝用量的防治效果相當，但使用成本顯著低于噻唑膦（圖4）。該項工作為植物寄生線蟲防控這一世界性難題提供了新的解決方案。
圖4 生物制造的反式烏頭酸粉劑對根結線蟲的田間防效實驗
該工作利用合成生物學策略開發了能實現反式烏頭酸大規模低成本生產的的綠色生物制造技術，為反式烏頭酸殺線劑的開發奠定了基礎，研究成果已經與山東魯抗舍里樂藥業完成技術轉讓。更重要的是，反式烏頭酸原料可及性困境的突破，將推動反式烏頭酸作為一種重要生物基化學品的下游應用技術開發，為生物基材料開發提供新選項。
微生物制造工程中心呂雪峰研究員和黃雪年研究員為本論文的共同通訊作者，耿策副研究員和魯抗醫藥靳志剛為論文的共同第一作者。本研究獲得了國家重點研發計劃、中科院先導A專項、國家自然科學基金和山東省人才計劃的支持。（文/圖 耿策 黃雪年）
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.06.007
Geng C.#, Jin Z.#, Gu M., Li J., Tang S., Guo Q., Zhang Y., Zhang W., Li Y., Huang X.*, Lu X.*, Microbial production of trans-aconitic acid. Metabolic Engineering, 2023.
授權專利：
(1) 呂雪峰; 黃雪年; 耿策; 張偉; 一種產烏頭酸的土曲霉菌株及其構建方法與應用, 2019-7-18, 中國, 專利號ZL 201910649851.1
(2) 呂雪峰; 耿策; 黃雪年; 王敏; 靳志剛; 曹海峰; 郭強; 李繼彬; 一種高產反式烏頭酸的基因工程菌及其構建方法與應用, 2020-8-26, 中國, 專利號ZL 202010867102.9
(3) 呂雪峰; 黃雪年; 耿策; 唐慎; 靳志剛; 曹海峰; 郭強; 李繼彬; 一種高產反式烏頭酸的重組土曲霉菌株及其制備方法與應用, 2020-8-26, 中國, 專利號ZL 202010866757.4
(4) 呂雪峰; 耿策; 黃雪年; 靳志剛; 曹海峰; 郭強; 李繼彬 ; 一種高產反式烏頭酸的重組土曲霉及其制備方法與應用, 2020-8-26, 中國, 專利號ZL 202010866709.5
(5) 呂雪峰; 黃雪年; 耿策; 唐慎; 靳志剛; 曹海峰; 郭強; 李繼彬 ; 一種高產反式烏頭酸的重組土曲霉菌株及其構建方法與應用, 2020-8-26, 中國, 專利號ZL 202010866728.8
